产生3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/02/2004 发布时间：2021-03-25

专利名称：产生3－甲基氨基－1－(噻吩－2－基)丙－1－醇的方法
技术领域：
本发明涉及用于制备式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，特别涉及制备S-对映体I-S的方法。
式I-S 的氨基丙醇I的S对映体是用于合成式II的抗抑郁剂度洛西汀(duloxetine)的重要前体 其中，B是带n个负电荷的无机或有机酸性基团，HnB是可药用的酸。
现有技术用于制备度洛西汀或其相应碱的方法是复杂的并必须使用手性试剂或手性起始化合物。
因而，EP-B-0273658描述了制备度洛西汀的相应碱的方法，将2-乙酰基噻吩通过Mannich反应与甲醛和二甲基胺反应，还原所得Mannich碱的酮基产生外消旋的(S)-3-N，N-二甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，用氟化萘将醇官能团醚化并最终将二甲基氨基基团转化为甲基氨基官能团进行所述制备。萘醚的目标对映体可通过使用手性起始材料获得或通过在终产物步骤进行外消旋物拆分，如通过与旋光酸形成盐的方法或通过在手性固定相上层析获得。
US-5,362,886描述了类似的方法，其中将S-扁桃酸加至在还原酮基后获得的外消旋丙醇中。将这方面获得的该醇的S对映体用于随后的反应步骤。
EP-A-0457559也描述了与EP-B-0273658中描述的方法相类似的方法。在该方法中，用不对称还原体系LAH-Icb(氢化铝锂-[(2R，2S)-(-)-4-二甲基氨基-1，2-二苯基-3-甲基-2-丁醇])还原Mannich碱的酮基产生S对映体形式的醇。除了成本，本发明的缺点还在于还原体系LAH-Icb的不稳定性，LAH-Icb仅能稳定几分钟。
在Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals，XXXVI卷，3号，213-223页中，W.J.Wheeler和F.kuo也描述了制备度洛西汀的方法。在该方法中，将噻吩-2-甲酰氯于Stille偶合中与乙烯基三-正丁基锡烷在存在催化量的苯甲基(氯)-双(三苯基膦)钯(II)时在DMPU(二甲基丙烯脲)中反应产生式II的1-(噻吩-2-基)丙烯酮， 随后通过用氯化氢处理将其转化为式III.1的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮 随后用手性唑硼烷和BH3将用该方法获得的氯化丙酮III.1还原，产生式IV.1-S的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
可将以这种方式获得的醇IV.1-S通过接连与碘化钠并随后与甲胺反应，转化为(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇1-S。通过随后接连与氢化钠、1-氟代萘以及氯化氢反应，可获得盐酸盐形式的度洛西汀。就此而论是不利的，首先，制备氯丙酮中间产物III.1需要许多步骤和昂贵的试剂。其次，将氯丙酮III.1转化为氨基醇时分离氯丙醇IV.1-S。然而申请人进行的研究已经表明这种氯丙醇不稳定并非常容易通过强烈的放热反应分解，这样不仅导致氨基醇的产量损失而且使得在工业规模上更难控制该反应。
可从文献中获知用于制备3-氯-1-(噻吩-2-基)丙基-1-酮的方法，3-氯-1-(噻吩-2-基)丙基-1-酮由W.J.Wheeler等描述并在合成度洛西汀期间作为中间产物产生。然而，现有技术的已知方法的缺点是形成的氯丙酮III.1的产量低或者必须使用难以处理的试剂。因而，在CR Acad.Sci.，Ser.，Ser.C，1979，288(1)，49-52中，A.Etienne等描述了通过将噻吩和3-氯丙酰氯在硝基甲烷溶剂中在存在三氯化铝作为路易斯酸催化剂时进行Friedel-Crafts反应制备氯丙酮III.1。氯丙酮III.1仅以7％的产量获得。如由Liu等在Chirality，12，26-29(2000)中描述的相应反应，在存在四氯化锡作为路易斯酸催化剂以及苯作为溶剂时，也得到不令人满意的产量。在Acta Chem.Scand.B 20(6)，1577-1587(1966)中，Meth-Cohn等描述在存在三氯化铁或三氯化铝时在噻吩上进行相应的Friedel-Crafts酰化作用，形成的氯丙酮III.1具有中等到良好的产量。该方法的缺点在于必须使用二硫化碳作为溶剂。
在Tetradron Lett.44,2003,4783-4787中，Kamal，G.B.R.Khanna、R.Ramu和T.Krishnaji描述度洛西汀前体(S)-3-羟基-3-(噻吩-2-基)丙腈的制备，该方法通过用氯代乙酰氯乙酰化噻吩、用硼氢化钠还原酮产生外消旋醇、用氰化物取代氯基并将外消旋腈醇与乙酸乙烯酯在存在洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(在硅藻土上固定)时反应，该脂肪酶选择性催化R对映体的酯化作用，从而保持未被酯化的目标S对映体可以以纯化的形式分离。关于该方法的缺点在于，一方面需要多个反应步骤，另一方面，由于酯化的R部分不再进一步反应产生度洛西汀，造成了一半腈醇的损失。
因此本发明的一个目的是提供用于制备3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，所述方法克服了上述现有技术的缺点。而且，本方法将以好的总体产量提供式I化合物，特别是也使得对映体选择性地制备S对映体I-S成为可能。
我们已经发现，通过首先用Friedel-Crafts反应将噻吩与β-卤代丙酰基卤或丙烯酰卤在存在路易斯酸时进行反应，且在分离反应产物前通入卤化氢来达到这一目标。此后，将得到的式III的3-卤代-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮 Hal＝卤素还原并将式IV的还原产物 与甲胺反应。
因此本发明涉及用于制备式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中a)噻吩在存在路易斯酸时与β-卤代丙酰基卤或丙烯酰基卤反应得到3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，在反应发生同时或之后但是在分离反应产物之前通入卤化氢，和b)将在a)步骤中获得的丙酮还原并然后，优选地不分离反应产物，与甲胺反应。
根据本发明的方法以好的总产量提供了目标化合物I。而且，卤代丙酮中间产物III的制备没有使用昂贵的有机锡试剂。不需要分离难以操作的卤代丙醇IV。而且，该方法使得可能以简单的方式通过在存在手性催化剂或手性还原剂时还原卤代丙酮中间产物III来对映体选择性地制备S对映体I-S，其中所述手性催化剂或手性还原剂表现出关于(S)-3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S形成的选择性。
在本发明的上下文中，“对映体选择性”表示S对映体的对映体过量值ee(％)，该值通过已知的方式，根据下式ee(％)＝[S对映体-R对映体/(S对映体-R对映体)]×100计算，至少为50％，优选至少80％，特别地至少为90％，尤其至少为95％。
作为在酰基化过程中，或优选在酰基化进行后但是在反应产物分离前通入卤化氢的结果，基本上没有获得1-噻吩-2-基-丙酮II作为步骤a)的终产物，该化合物在现有技术的方法中总作为副产物出现并减少了目标酰化产物III的产量。
具有电子对空位的共价金属卤化物或半金属卤化物适合用作路易斯酸。通常，它们选自钛、锡、铝、钒、铁或硼的卤素化合物。优选氯化物；然而，当使用铝时，二氯化单烷基铝和氯化二烷基铝也是合适的。使用硼时，氟化物也是合适的。合适的路易斯酸的实例是四氯化钛、三氯化硼、三氟化硼、四氯化锡、五氯化钒、三氯化铁、三氯化铝、二氯化烷基铝和氯化二烷基铝。特别优选使用三氯化铝。
合适的β-卤代丙酰卤是3-氯丙酰氯和3-溴丙酰溴或者3-溴丙酰氯。优选使用3-氯丙酰氯。
优选将丙烯酰氯作为丙烯酰卤使用。
β-卤代丙酰卤优选在步骤a)中用作酰化剂。
氯化氢和溴化氢是合适的卤化氢。优选使用卤化氢，其中卤素原子对应于所用的β-卤代丙酰卤中β-卤素基团。因此，当使用3-氯代丙酰氯时，优选使用氯化氢。
在Friedel-Crafts酰化反应中通常使用的所有溶剂都适合用作步骤a)中用来反应的溶剂。原则上，合适的溶剂是质子惰性溶剂，其不降低所用的试剂，特别是路易斯酸的反应性，或不在给定反应条件下进入与路易斯酸的任何竞争反应。这些溶剂的实例是自身酰化的芳香族试剂(即噻吩)、比噻吩明显更难酰化的芳烃，如苯、硝基苯和卤代芳烃，如氯苯和二氯苯以及卤代脂族烃，特别是卤代烷如氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷。上述溶剂和混合物也是合适的。优选使用如硝基苯或卤代烃的溶剂，其中Friedel-Crafts酰化可基本均相地进行。特别是优选卤代芳烃或脂族烃，特别优选卤代烷。特别使用二氯乙烷或氯苯。
路易斯酸必须基于理论上要获得的酰基化噻吩的量以至少等摩尔量使用，因为路易斯酸与在酰化期间形成的酮形成络合物，该络合物在Friedel-Crafts反应的常规条件下保持稳定。基于以更小比例使用的1摩尔的酰化组分(噻吩或β-卤代丙酰卤)，路易斯酸优选以1∶1-1∶2、特别优选1∶1-1∶1.5，特别是1∶1.1-1∶1.5的摩尔比使用。
噻吩和β-卤代丙酰卤以优选1∶0.5-1∶2、特别优选1∶0.7-1∶1.5，特别是1∶0.8-1∶1.2的摩尔比使用。
与Friedel-Crafts酰化有关，将试剂一起加入的顺序是次要的。因而，可能例如最初将路易斯酸导入溶剂中并首先加入β-卤代丙酰卤并然后加入噻吩。备选地，可能最初引入噻吩和路易斯酸并将β-卤代丙酰卤加入它们。
通常，当加入β-卤代丙酰卤时进行冷却是有利的，因为路易斯酸和酰基卤的反应通常是强烈放热的。尤其依赖溶剂选择反应温度。温度通常在10℃-40℃的范围内。当使用卤代烃，尤其是卤代烷时，反应温度适宜地最高为50℃，因为否则，溶剂将自身反应。反应温度优选为-20℃-40℃，特别优选为0-30℃。
原则上，反应压力不是关键的。通常，反应在常压下进行；然而也可以在正压或负压下进行。例如，当溶剂在通常条件下高度挥发或不是液体，如当使用氯甲烷时，使用正压。
优选在酰化发生后通入卤化氢。现有技术的常规方法如气相层析法、薄层层析法或NMR波谱法可用来确定酰化反应的完成。在每种情况下，通入发生的时间尤其取决于批大小并可通过技术人员确定。通常，通入卤化氢至少直到不再可能检测到任何1-噻吩-2基丙酮。
为了检查酰化产物，通常最初将反应混合物进行水解处理以断裂已经形成的酮-路易斯酸络合物。将水或经稀释的含水无机酸，如稀盐酸用于水解。用已知的方法，如在Organikum[Practical course in organicchemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，1988年，323页以及以下等等中描述的方法实现进一步纯化和分离。
根据本发明的方法在步骤a)中产生高产量的3-卤代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III。在酰化反应过程中可以形成的任何1-噻吩-2-基丙酮II基本上完全转化为3-卤代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III，这样基于3-卤代-(噻吩-2-基)-1-丙酮III的产量，反应混合物含有至多1mol％，特别优选至多0.5mol％的丙酮II。
例如通过使用金属氢化物或半金属氢化物或使用氢在存在合适的过渡金属催化剂时完成步骤b)中的丙酮III的还原。
合适的金属氢化物或半金属氢化物既是中性的又分别是金属和半金属的配位氢化物。可有利地使用已经证明在将酮还原为醇中具有价值的金属氢化物或半金属氢化物。氢化物优选为硼或铝的氢化物。
合适的中性氢化物的实例是硼烷(BH3；B2H6)、铝烷(AlH3)、硅烷(SiH4)、单硼烷和二烷基硼烷，如双(3-甲基丁-2-基)硼烷、(二唾液酸基硼烷)或9-硼双环[3.3.1]壬烷(9-BBN)、单烷基铝和二烷基铝化合物，如二异丁基氢化铝(DIBAL-H)和三烷基硅烷，如三甲基硅烷或三乙基硅烷。
合适的配位氢化物的实例是配位硼氢化物如硼氢化钠(NaBH4)、硼氢化锂(LiBH4)、或硼氢化钙Ca[BH4]2，配位氢化铝，如氢化锂铝(LiAlH4)、配位烷基硼氢化物或烷氧基硼氢化物，如三乙基硼氢化锂或三异丙氧基硼氢化钾(KB(OCH(CH3)2)3H)，或配位烷基氢化铝或烷氧基氢化铝，如二乙基氢化铝钠、双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝锂(LiAl[OC2H4OCH3]2H2)、双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(NaAl[OC2H4OCH3]2H2；“红Al”)或三(叔丁氧基)氢化锂铝(LiAl[OC(CH3)3]3H)等。
适合用于用金属氢化物或半金属氢化物还原的溶剂特别取决于所使用的还原剂并应该本身不含有任何在反应条件下也能还原的基团。因此，使用上述氢化物的还原优选地在质子惰性溶剂中进行，所述质子惰性溶剂不含在给定反应条件下能被还原的官能团。这些溶剂的实例是芳烃和脂族烃，例如C5-C8-烷和C5-C8-环烷，如戊烷、己烷、庚烷、环戊烷、环己烷和环辛烷，芳族化合物，如苯、甲苯、硝基苯、氯苯和二氯苯，以及，具有4-8个碳原子的开链和环醚，如二乙醚、甲基叔丁醚、四氢呋喃或二烷，以及氯化烃类，特别是卤代烷如氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或三氯乙烷。上述溶剂的混合物也是合适的。优选使用上述芳烃、醚或卤代烃。
用上述的一些配位氢化物，特别是用反应性较小的氢化物如硼氢化钠进行的还原反应可以在存在质子溶剂例如C1-C3-醇类，如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇时或甚至在水溶液中也可以实现。在这种情况下，优选使用由至少一种先前提到的质子惰性溶剂和至少一种醇组成的混合物。因为氢化物在碱性质子溶液中更稳定，当使用质子溶剂时，反应优选地在存在合适的碱时进行。合适的碱的实例是碱金属氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾，或碱金属碳酸盐，如碳酸钠或碳酸钾。优选使用氢氧化钠。
当使用许多先前提到的金属氢化物或半金属氢化物时，还原反应通常放热进行，这样在除去反应热，即冷却下适宜地进行反应。反应温度优选为-50至40℃，特别优选为-30至30℃并且尤其为-20至20℃。使用现有技术的常规方法如由例如Organikum[Practical course in organicchemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，1988年，492页以及以下描述的方法可以进行还原反应。在这些方法中，通常最初将丙酮III导入并按份加入还原剂。然而，也可以将丙酮和还原剂按份同时加入。
例如，也可用烃醇铝还原丙酮III。用烃醇铝还原酮通常也称为Meerwein-Ponndorf-Verley还原。在该还原反应中，酮转化为相应的醇并且同时将醇盐氧化为相应的醛(在由伯醇形成的醇盐的情况时)或酮(在由仲醇形成的醇盐的情况时)。反应可以用例如在Organikum[Practical coursein organic chemistry]，VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften，第17版，486页以及以下描述的已知方法进行。
而且，也可以通过催化加氢的方式还原丙酮III，即通过在存在合适的过渡金属催化剂时将丙酮III与氢反应还原丙酮III。合适的过渡金属包括VIII、VI和I副族金属，特别是铂、钌、铜、铬和镍。自然，必须选择催化剂以使得它们不能催化噻吩基的氢化。催化剂可用作非匀相催化剂或用作匀相催化剂。合适的方法大体上已知并在例如Transition Matals inOrganic Synthesis.M.Beller，C.Bolm，Wiley-VCH，Weinheim，1998年，第2卷，第1页及以后等(匀相催化剂)或者第81页及以后(非匀相催化剂)中描述。
用金属氢化物或半金属氢化物并特别优选用一种上述配位金属氢化物或半金属氢化物优选实现步骤b)中的还原。特别是使用硼氢化钠。
当使用上面描述的非对称还原剂时，前手性3-卤-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮III主要还原为外消旋的醇IV。随后与甲胺反应相应地产生外消旋的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮I。
在优选的实施方案中，使用根据本发明的方法制备式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇 或制备该化合物和它的R对映体I-R一起的混合物，其中对映体I-S占优势，步骤b)中的还原反应在存在手性还原剂或表现出关于(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S的形成的选择性的手性催化剂时进行。
当完成这些后，在步骤b)中将前手性卤代丙酮III对映体选择性还原成式IV-S的S-卤代丙醇 或S和R对映体的混合物，其中S对映体占优势。为此，例如使用不对称金属氢化物或半金属氢化物作为步骤b)中的还原剂，或在存在介导不对称诱导的化合物时进行还原。
不对称金属氢化物或半金属氢化物优选是不对称的氢化铝、氢化硼或氢化硅。合适的不对称硼氢化物如在E.J.Corey，C.J.Helal，Angew.Chem.1998，110，2092-2118或在M.M.Midland、L.A.Morell，Methoden Org.Chem.[Methods of organic chemistry]，Houben-Weyl，第4版，卷E21d，4082-4098页，1995年中描述，将它们全文引用作为参考。合适的不对称氢化硅尤其在H.Brunner，Methoden Org.Chem.[Methods of organicchemistry]，Houben-Weyl，第4版，卷E 21d，4074-4081页，1995年中描述，同样特此全文引用作为参考。
在本发明上下文中，将介导不对称诱导的化合物认为是这样的化合物，其通过影响实际的还原剂，例如通过与还原剂形成键或形成络合物，或通过从还原剂吸收氢原子或另一还原性部分，使得对映体选择性地还原丙酮III。通常，介导不对称诱导的化合物本身不具还原性。
一方面，这些化合物包括不对称加氢催化剂。在不对称氢化作用中，氢作为实际的还原剂而不对称催化剂促成对映体选择性地形成一种可能的对映体。氢化作用或在非均相中或在匀相中进行。用于在非均相中不对称氢化的合适催化剂是例如在A.Baiker，H.U.Blaser in Handbook ofHeterogeneous Catalysis，第5卷(编辑G.Ertl、Knrzinger和J.Weitkamp)，Wiley-VCH，Weinheim，1997，2422-2436中描述，这里通过全文引用作为参考。
然而，用于在均相中氢化的催化剂更加重要。包含副族VIII金属如铂或钌，特别是钌，以及至少一个含磷配体的催化剂是特别合适的。合适的催化剂描述于例如R.Noyori，T.Ohkuma，Angew.Chem.2001，113，40-75中，这里通过全文引用将其作为参考。特别适宜的是钌(II)肼络合物，其中钌额外地结合双配位基手性二膦配体。适合用于将卤代丙酮III还原为S-卤代丙醇IV-S的二膦配体的实例是式A的(R)-BINAP、式B的(R，R)-DIOP和式C的(R，R)-CHIRAPHOS Ar＝苯基(BINAP)Ph＝苯基4-甲基苯基(TolBINAP)3，5-二甲基苯基(XylBINAP)而且，特别优选的催化剂含有肼配体。合适的肼配体的实例是对映体形式的1，2-乙二胺、1，2-二苯基-1，2-乙二胺和1，2-环己二胺。
通常，氢化作用在先前描述的条件下进行。
式D的oxzaborylidine是特别优选的介导不对称诱导的化合物 其中R是C1-C4-烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基并特别是甲基。
该试剂可用于以高度对映体选择性将前手性酮转化为仲醇(E.J.Corey，Pure Appl.Chem.62，1209，1990；E.J.Corey，J.O.Link，J.Am.Chem.Soc.114，1906，1992)。将硼烷，如BH3、二烷基硼烷、二烷氧基硼烷或二芳氧基硼烷用作实际的还原剂。W.J.Wheeler和F.Kuo已经在Journal of Labelled Compounds和Radiopharmaceuticals，XXXVI卷，No.3，213-223中描述了氯代丙酮III.1与oxazaborylidine D(R＝甲基)和BH3反应产生S-氯代丙醇IV.1-S。
在还原反应中，oxazaborylidine通常以催化量使用。尽管将硼烷基于卤代丙酮III至少以等摩尔量使用，但是优选过量使用。反应通常在合适的溶剂中进行。合适的溶剂是质子惰性溶剂，其不具有在给定还原条件下能被还原的基团。这些溶剂包括，特别是前面提到的卤代烷烃、芳香族化合物和环状或无环醚。优选使用醚，四氢呋喃是特别优选的。反应温度优选从-80至20℃，特别优选从-30至10℃。通常进行反应使得最初将oxazaborylidine导入溶剂中并或者首先加入硼烷并随后加入卤代丙酮III或相反地，先加入卤代丙酮III然后加入硼烷，在所希望的反应温度下进行，优选第一种加入步骤。反应持续时间尤其决于反应批量的大小并在每种情况下由技术人员确定。
令人惊奇的是，发现当用酶催化，特别是存在脱氢酶时，将丙酮III对映体选择性地还原成S-卤代丙醇IV-S进行得很好。因此在根据本发明的方法的另一优选实施方案中将脱氢酶用作还原剂。
根据本发明的方法中的还原已经完成后，并取决于所用的还原方法，适宜时，将所用的催化剂或过量的还原剂失活或除去。当使用金属氢化物或半金属氢化物时，这通常通过水解，如用水溶液或醇溶液水解来实现。当用均相加氢催化剂或当用烃醇铝还原时，也经常使用催化处理。如果在非均相中以催化加氢的形式进行还原，或用酶作为还原剂，那么可以通过物理分离，如通过倾析或过滤除去催化剂或酶。然而，当使用均相还原体系时，特别是当用金属氢化物或半金属氢化物进行还原时，优选最初不进行失活。
已经证明将还原后获得的卤代丙醇IV不经分离而直接与甲胺反应生成3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I是有利的。为此，可将反应混合物用甲胺处理并反应，优选在升高的温度如在30至80℃，特别是在50至70℃时反应，其中所述反应混合物适宜时已经经过失活处理或已经从非均相还原体系分离。甲胺以气体形式使用或作为水溶液使用，优选作为水溶液使用。基于使用的卤代丙酮III的量，优选以1-100摩尔当量，特别优选5-10摩尔当量的量使用卤代丙酮III。优选在1-250巴的压强下，并特别是在系统自己产生的固有压强下实现反应。
和甲胺的反应已经完成后，以常规的方式处理反应混合液。为此，如果在加入甲胺之前没有处理，那么按照已经描述的，将催化剂或还原剂失活并分离，之后，将溶剂除去并通过例如结晶、消化、萃取或层析法从残余物中分离纯的甲基氨基丙醇I。
也可能用根据本发明的方法来获得好产量的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I。具体地，步骤a)中不需要昂贵的或难以操作的试剂或溶剂并且形成十分高产量的卤代丙酮。步骤b)中，避免了不稳定的卤代丙醇IV的分离以及与之相关的卤代丙醇IV的产量损失和/或它的难以操作。而且，根据本发明的方法可用于选择性的获得甲基氨基丙醇I-S的S对映体，如果使用手性还原剂进行步骤b)中的还原，那么该对映体对进一步转化为度洛西汀是必需的。
而且，本发明还涉及用于制备式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，方法中对映体选择性地还原3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，包括在存在脱氢酶时进行还原。在该方法的优选实施方案中，将就此获得的(S)-3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇IV-S与甲胺反应而不需分离。关于合适的和优选的脱氢酶及关于实施方法，读者可清楚地参照下面的观察。
生物化学实施方案合适的脱氢酶(EC 1.1.X.X)特别是脱氢酶(EC 1.1.1.X)，特别是引起卤代丙酮III选择性地还原为S-卤代丙醇IV-S的醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2)。脱氢酶优选从微生物、特别优选从细菌或真菌，特别是酵母中获得，这些微生物在每种情况下在菌株保藏中心保藏或可从天然来源分离物如土壤样品、生物量样品等获得。脱氢酶特别源于酵母或乳酸细菌。
脱氢酶能以纯化或部分纯化的形式或微生物本身的形式使用。从微生物分离和纯化脱氢酶的方法是技术人员足够公知的，例如从K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中的K.Nakamura amp;T.Matsuda，，“Reduction of Ketones”获知。生产脱氢酶的重组方法也可从例如W.Hummel，K.Abokitse，K.Drauz，C.Rollman和H.Grger，Adv.Synth.Catal.2003，345，Nos.1+2，pp.153-159获知。
合适的细菌实例是假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)的那些细菌。合适的酵母样品是地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(hansenula)或酵母属(saccharomyces)。
特别优选使用源于酵母和乳酸细菌的脱氢酶。这些脱氢酶中，优选地是那些从地霉属或假丝酵母属酵母获得的脱氢酶或者是那些从乳杆菌属或乳球菌属的乳酸细菌获得的脱氢酶。
乳杆菌种的实例是短乳杆菌(L.brevis)、克非尔乳杆菌(L.kefir)、植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌(L.casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)和旧金山乳杆菌(L.sanfrancisco)。
假丝酵母种的实例是木兰假丝酵母菌(C.magnoliae)、皱褶假丝酵母(C.rugosa)、产朊假丝酵母(C.utilis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和南极洲假丝酵母(C.antarctica)。
地霉种的实例是白地霉(G.candidum)、棒地霉(G.clavatum)和发酵地霉(G.fermentans)。
特别优选使用源于木兰假丝酵母菌、白地霉或短乳杆菌的脱氢酶。
用脱氢酶还原通常在存在合适的辅酶(也称辅因子)时进行。通常将NADH和/或NADPH用作辅酶来还原酮。而且，可能以本身含有辅因子的细胞体系使用脱氢酶，或可加入备选的氧化还原介体(A.Schmidt，F.Hollmann和B.Bühler“Oxidation of Alcohols”in K.Drauzand H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2000，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。
用脱氢酶还原也通常在存在合适的共底物时完成，所述共底物通常作为在还原过程中经氧化的辅酶的还原剂并因而再生这种辅酶。合适的共底物的实例是糖类，特别是己糖如葡萄糖、甘露糖或果糖，和/或可氧化的醇，特别是乙醇、丙醇或异丙醇，也可以是甲酸盐。可以加入另一种脱氢酶，例如当将葡萄糖作为共底物时可加入葡萄糖脱氢酶，以便氧化共底物，与此相关，用来再生辅酶。这种脱氢酶可以作为游离的或固定化酶或以游离细胞或固定化细胞的形式使用。脱氢酶或者可以单独地制备或者通过在(重组)脱氢酶菌株中共表达来制备。
根据本发明使用的脱氢酶能以游离或固定化形式使用。固定化酶可以理解为固定至惰性支持体的酶。合适的支持材料以及固定在它们上的酶可以从EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-OS 100193773获知，并且也可以从其中引用的参考文献中获知。在这一点上，这些文献中的公开内容通过全文引用作为参考。合适的支持材料包括例如粘土、粘土矿物如高岭土、硅藻土、珠光体、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯以及聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。将支持材料用于制备受支持的酶，其通常是细分的微粒形式，优选多孔形式。支持材料的颗粒大小通常不超过5mm，特别是不超过2mm(分级曲线)。以类似的方式，当将脱氢酶作为完整细胞催化剂使用时，可以选择游离或固定化形式。支持材料的实例是藻酸钙和角叉菜胶。酶及细胞能直接与戊二醛交联(交联产生CLEAs)。相应的，另外的固定化方法例如在J.Lalonde和A.Margolin“Immobilization ofEnzymes”in K.Drauz and H.Waldmann，Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis 2002，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中描述。
还原反应能在含水或不含水的反应介质中或双相体系或(微)乳剂中进行。含水反应介质优选是缓冲液，通其pH值为5-8，优选为6-8。除了水，含水溶剂可另外含有至少一种醇，如乙醇或异丙醇。
“非含水反应介质”应该理解为反应介质，其基于该反应介质的总重量，含有按重量计少于1％、优选少于0.5％的水。反应优选在有机溶剂中进行。合适的溶剂的实例是脂族烃，优选具有5-8个碳原子的脂族烃，如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷，卤化脂族烃，优选具有一个或两个碳原子的卤化脂族烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷，芳烃，如苯、甲苯、二甲苯类、氯苯或二氯苯、脂族无环的和环醚类，优选具有4-8个碳原子的脂族无环的和环醚类，如二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚或四氢呋喃或酯类，如乙酸乙酯或乙酸正丁酯或酮类，如甲基异丙基酮或二烷，或它们的混合物。特别优选使用上述的醚类，特别是四氢呋喃。
例如，用脱氢酶的还原在含水有机物，特别是在含水反应介质中进行。
在酶促还原中，优选使用0.1g/l-500g/l，特别优选1g/l-50g/l浓度的卤代丙酮III并且其可随后连续或不连续地提供。
通常，酶促还原在低于使使用的脱氢酶失活的温度并优选为至少-10℃的反应温度下进行。反应温度特别优选为0-100℃，特别为15-60℃，并尤其为20-40℃，例如约30℃。
为了实现反应，例如可以最初将卤代丙酮III和脱氢酶、溶剂以及，如果适宜，和辅酶，如果适宜，和用于再生辅酶的辅助脱氢酶，和/或其它共底物一起引入，并混合混合物，如通过搅拌或摇动混合。然而，也可能将脱氢酶固定在反应器，如柱中，并将含有卤代丙酮III和如果适宜，辅酶和/或共底物的混合物穿过反应器。为此，可能将混合物以循环过程通过反应器直到实现所希望的转化。在这方面，卤代丙酮III的酮基还原为OH基，连同基本上选择性地形成了卤代丙醇IV-S的S对应体。基于混合物中存在的卤代丙酮III，通常进行还原直到至少70％，特别优选至少85％，并特别是至少95％的转化。关于这一点，反应的进展，即酮的顺序还原可通过常规方法如气相层析法监视。
根据本发明的方法特别优选使用的脱氢酶是醇脱氢酶，其具有至少一种下列性质
具有以下氨基酸序列的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶在N端区a)包含至少5、6、7或8，优选至少10个，例如10、11、12、13、14或15个如SEQID NO1中描述的连续氨基酸残基的组成型氨基酸序列，其中对应SEQ IDNO1中描述的氨基酸位置12的位置优选另外地代表缬氨酸；或b)包含至少5、6、7或8，优选至少10个，例如10、11、12、13、14或15个如SEQID NO2中描述的连续氨基酸残基的组成型氨基酸序列；和其功能等价物。
能将3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮还原为(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的醇脱氢酶。
以至少85％ee的对映体纯度催化还原(存在NADH和/或NADPH；在30℃和pH6.0)的醇脱氢酶。
醇脱氢酶，其由包含SEQ ID NO3的核酸序列编码或包含如SEQ IDNO4描述的氨基酸序列或至少如图3中描述的组成序列，可优选地从短乳杆菌获得；以及源于所述脱氢酶的功能等价的醇脱氢酶。
醇脱氢酶，其由包含SEQ ID NO5的核酸序列编码或具有包含SEQID NO6的氨基酸序列，并可优选地从木兰假丝酵母(ATCC 12573)获得；以及源于所述脱氢酶的功能等价的醇脱氢酶。
本发明还涉及具有至少一种上面所列的性质的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇脱氢酶。
其中脱氢酶稳定的温度范围优选是10-80℃。其活性最优时的温度优选为20-60℃，特别优选25-40℃。脱氢酶在其中稳定的pH范围优选为pH4-10。脱氢的最适pH优选为pH 5-8。
而且，根据本发明的脱氢酶优选地能在NAD+或NADP+存在下使(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇脱氢产生3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮。它优选具有30±2千道尔顿的分子量。
本发明还涉及包含根据本发明的脱氢酶的编码序列或组成型编码序列的核酸序列。它的非限制性实例是在SEQ ID NO3或SEQ ID NO6中描述的序列。
本发明进一步涉及表达盒，所述表达盒包含根据本发明的核酸序列，其与至少一个调节核酸序列有效连接。
本发明进一步涉及重组载体，所述载体包含至少一个根据本发明的表达盒。
而且，本发明涉及用至少一个根据本发明的载体转化的原核或真核宿主。
最后，本发明涉及使用根据本发明的脱氢酶，或产生这种脱氢酶的微生物来制备(S)-3-卤代-1-(噻烯-2-基)丙-1-醇并且，特别是用于制备度洛西汀。
根据本发明的脱氢酶的进一步修饰本发明还包括特定公开的酶的“功能等价物”，其具有(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇脱氢酶活性，还包括这些等价物在根据本发明的方法中的用途。
在本发明的上下文内，特定公开的酶的“功能等价物”或类似物是不同于这些酶但仍具有目标生物活性如底物特异性的多肽。因而，“功能等价物”可例如理解为指这样的酶，其将3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮还原为相应的S醇，并且具有包含在SEQ ID NO1、2、4或6列出或图3中描述的氨基酸序列之一的酶活性的至少20％、优选50％、特别优选75％、十分特别优选90％。功能等价物也优选在pH 4-10是稳定的，并且有利地具有5-8的最适pH以及20-80℃的最适温度。
根据本发明，“功能等价物”也具体地理解为指突变体，所述突变体在上述氨基酸序列中的至少一个序列位置中具有不同于特别提到的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上述生物活性一种。“功能等价物”因而包含可通过一个或多个氨基酸添加、氨基酸替代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒位获得的突变体，所述改变可以出现在任意序列位置，只要它们产生具有根据本发明性质谱的突变体。具体地，当突变体和未改变的多肽的反应性模式在性质上一致时，即同样的底物例如以不同的速率被转化时，也存在功能等价物。合适的氨基酸替代的实例在下表中列出
原始残基 替代的实例AlaSerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn；GlnlleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu上述意义的“功能等价物”也是所述多肽的“前体”以及这些多肽的“官能衍生物”和“盐”。
就此而论，“前体”是多肽的天然或合成的前体，所述前体具有或不具有目标生物活性。
表述“盐”可理解为根据本发明的蛋白质分子的羧基的盐和氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以自身已知的方式制备并包括无机盐，如钠、钙、铵、铁和锌盐，以及与有机碱形成的盐，所述有机碱为例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成盐，例如与无机酸，如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸，如乙酸和草酸形成的盐，同样构成了本发明的部分。
根据本发明多肽的“官能衍生物”同样可以用已知的技术在官能氨基酸侧基或在它们的N-端或C-端制备。这些衍生物包括，例如羧酸基团的脂族酯；羧酸基团的酰胺，所述酰胺可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得；游离氨基的N-酰基衍生物，所述衍生物通过与酰基反应制备；或游离羟基的O-酰基衍生物，所述衍生物通过与酰基反应制备。
在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的“功能等价物”包括去糖基化或糖基化形式的上述类型的蛋白质以及可通过改变糖基化模式获得的经修饰的形式。
“功能等价物”自然也包括从其它生物中获得的多肽和自然出现的变体。例如，同源序列区的区域可通过序列比较确定并且等价酶可用本发明的特定方针鉴别。
“功能等价物”还包括根据本发明多肽的片段，优选个别结构域或者序列基序，所述片段具有例如，所希望的生物学功能。
而且，“功能等价物”是含有一个上述多肽序列或源于它的功能等价物，以及至少一个其它异源序列的融合蛋白，所述异源序列功能上与之不同并功能地连接N-端或C-端(即融合蛋白的各部分没有显著的相互功能削弱)。这种异源序列的非限制性实例是信号肽或酶。
也包括于本发明的“功能等价物”是特定公开的蛋白质的同源物。这些同源物与特定公开的氨基酸序列之一具有至少60％、优选至少75％、特别是至少85％，如90％、95％、97％或99％的同源性，所述同源性用Pearson和lipman算法，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448计算。根据本发明的同源多肽的百分比同源性具体指基于此处明确描述的一个氨基酸序列的全长的氨基酸残基的百分比同一性。
根据本发明的蛋白质或多肽的同源物可通过诱变产生，例如通过蛋白质的点突变或截短产生。根据本发明的蛋白质的同源物可通过筛选突变体如截短突变体的组合文库鉴定。例如，蛋白质变体的多样化文库可通过在核酸水平上的组合诱变产生，例如通过酶促连接合成的寡核苷酸的混合物产生。有许多方法可用于从简并的寡核酸序列制备潜在同源物的文库。简并基因序列可在自动DNA合成机器上通过化学合成并且合成的基因可连接进合适的表达载体中。使用简并基因集使得可能以混合物制备编码潜在蛋白质序列的目的集的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人，(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
用于筛选已经通过点突变或截短制备的组合文库基因产物以及用于筛选cDNA文库中具有所选性质的基因产物的几种技术是现有技术已知的。这些技术可适用于快速筛选通过将根据本发明的同源物组合诱变产生的基因文库。用来筛选接受高通量分析的大型基因文库的最常用技术包括将基因文库克隆至可复制表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞并在一定条件下表达组合基因，在所述条件下检测目标活性有助于分离载体，该载体编码将检测其产物的基因。递归总体诱变(Recursive ensemblemutagenesis)(REM)是增加文库中功能性突变的频率的技术，可与筛选测试结合使用以便鉴别同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
根据本发明的编码核酸序列的其他实施方案具体地，本发明涉及核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，该核酸序列编码具有根据本发明的脱氢酶活性的酶。优选例如，编码如SEQ ID NO1、2、4、6或图3中描述的氨基酸序列或其特征性组成序列的核酸序列，或包含如SEQ ID NO3或5中描述的核酸序列或其特征性组成序列的核酸序列。
所有在此提到的核酸序列可以以本身已知的方式，通过从核苷酸结构单元化学合成制备，如通过双螺旋的个别重叠的互补核酸结构单元的片段缩合制备。寡核苷酸可例如以已知方式，用亚磷酰胺方法(Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)化学合成。合成的寡核苷酸的附着以及用DNA聚合酶Klenow片段填充缺口和连接反应，以及常规克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular CloningA laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press中描述。
本发明还涉及编码一种上面的多肽和它们的功能等价物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，所述功能等价物例如可以用人造核苷酸类似物获得。
本发明涉及经分离的核酸分子，其编码根据本发明的多肽或蛋白质或其生物活性片段，还涉及可例如用作杂交探针或引物来鉴定或扩增根据本发明的编码核酸的核酸片段。
根据本发明的核酸分子可还含有编码基因区的3’端和/或5’端的非翻译序列。
本发明也包括与特定描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其片段。
根据本发明的核酸序列使得能产生可用于鉴定和/或克隆其它细胞类型或生物体中的同源序列的探针和引物。这些探针或引物通常包括核苷酸序列区，所述核苷酸序列区在“严格”条件下(见下文)与根据本发明的核酸序列的有义链或相应的反义链中的至少约12个，优选至少约25个，如约40、50或75个连续核苷酸杂交。
“分离的”核酸分子与存在于该核酸的天然来源的其它核苷酸分子分离，所述核酸分子当通过重组技术制备时基本无其它细胞材料或培养基或通过化学合成时基本无化学前体。
根据本发明的核酸分子可用标准的分子生物学技术和根据本发明提供的序列信息分离。例如，可通过使用一种特定公开的完整序列或其片段作为杂交探针并使用标准的杂交技术(例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Mannual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989描述)从合适的cDNA文库分离cDNA。而且，可用聚合酶链式反应来分离包含一种公开的序列或其片段的核酸分子，所述方法使用基于这个序列构建的寡核苷酸引物。可将以这种方式扩增的核酸克隆至合适的载体中并通过DNA序列分析表征。根据本发明的寡核苷酸也可通过标准的合成方法，如使用自动DNA合成设备制备。原则上，根据本发明的核酸序列可在任意生物体中鉴定或从其分离。有利地，根据本发明的核酸序列或其同源物可从真菌、酵母或细菌中分离。可以提到的细菌是革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。根据本发明的核酸优选地从革兰氏阴性细菌，有利地从α-变形菌(alpha-proteobacteria)、β-变形菌(beta-proteobacteria)或γ-变形菌(gamma-proteobacteria)，特别优选从肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)或根瘤菌科(Rhizobiaceae)，特别优选从土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属或伯克霍尔德菌属(Burkholderia)中用技术人员已知的方法分离。
根据本发明的核酸序列可以，例如，用常规的杂交方法或PCR技术如通过基因组或cDNA文库从其它真菌或细菌中分离。这些DNA序列在标准条件下与根据本发明的序列杂交。有利地使用来自保守区，如来自活性中心的短寡核苷酸用于杂交，使得可能以技术人员已知的方式通过与根据本发明的脱氢酶比较来鉴定这些寡核苷酸。然而，也可能使用根据本发明的核酸的更长的片段或全长序列用于杂交。这些标准条件取决于使用的核酸(寡核苷酸、更长的片段或完全序列)或取决于用于杂交的核酸类型DNA或RNA而不同。因而，DNADNA杂合分子的解链温度比同样长度的DNARNA杂合分子的温度低约10℃。
取决于核酸，标准条件可理解为例如，温度在42-58℃之间，在含有0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的浓度的含水缓冲液中，或额外存在50％甲酰胺，例如42℃，在5×SSC，50％甲酰胺中。有利地是，用于DNADNA杂交的杂交条件是0.1×SSC以及温度约20℃-45℃，优选约30℃-45℃。对于DNARNA杂交，杂交条件有利地是0.1×SSC以及温度约30℃-55℃，优选约45℃-55℃。这些特定用于杂交的温度是解链温度值，该值已经通过例如具有长约100个核苷以及50％的G+C含量的核酸，在缺少甲酰胺的条件下计算得到。用于DNA杂交的实验条件描述于遗传学教科书中，如Sambrook等人，“MolecularCloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并可以用技术人员已知的公式计算，例如取决于核酸的长度、杂合分子的性质或G+C含量。技术人员可进一步从以下教科书获得有关杂交的信息Ausubel等人(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley amp; Sons，NewYork；Hames和Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids HybridizationAPractical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press，Oxford。
本发明还涉及特定公开的或可推导出的核酸序列的衍生物。
因而，根据本发明的进一步的核酸序列可源于，例如SEQ ID NO3或5并通过加入、替代、插入或缺失单个或几个核苷酸而与其不同但仍然编码具有目标特性谱的多肽。
本发明还包括那些包含根据原始特定生物体或宿主生物体的密码子选择，称为沉默突变或与特定提及的序列相比改变的那些核酸序列及天然发生的变体，如剪接变体或等位基因变体。
本发明同样涉及通过保守核苷酸替代获得的序列(例如用相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替代所讨论的氨基酸)。
本发明还涉及由于序列多态性源于特定公开的核酸的分子。这些遗传多态性可存在于自然变异产生的群体内的个体之间。这些自然变异通常在基因的核苷酸序列中引起1-5％的变化。
“根据本发明的核酸序列的衍生物”可理解为，例如等位基因变体，所述等位基因变体在推导的氨基酸水平上在全长序列区上(关于氨基酸水平的同源性，读者可参考上面关于多肽的观察(observation))具有至少40％的同源性，优选至少60％同源性，特别优选至少80、85、90、93、95或98％的同源性。在序列的组成区上，同源性可有利地更高。
而且，“衍生物”也可理解为根据本发明的核酸序列的同源物，如真菌的或细菌的同源物、截短的序列或编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。因此它们，例如在DNA水平上，在指定的完整DNA区具有至少40％、优选至少60％、特别优选至少70％、十分特别优选至少80％的同源性。
而且，“衍生物”也可理解为例如和启动子的融合物。启动子位于给定核酸序列的上游，可通过一个或多个核苷酸交换、插入、倒位和/或缺失来改变，而没有削弱启动子的功能性或活性。而且，可通过改变它们的序列增加启动子的活性，或启动子可用更有活性的启动子，包括来自属于其它物种生物体的那些启动子代替。
“衍生物”也可理解变体，其核苷酸序列在起始密码子上游-1到-1000号碱基区域中或终止密码子下游0到1000号碱基区域中受到改变，从而基因表达和/或蛋白质表达受到改变，优选得以增强。
本发明也进一步包含在“严格条件”下与上述编码序列杂交的核酸序列。这种性质可理解为多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下结合至几乎互补的序列，而在这些条件下，在非互补的两者之间的不形成非特异键的能力。为此，序列应该是70-100％、优选90-100％互补的。互补序列能特异地相互结合的特征例如在RNA印迹或蛋白质印迹技术中或与引物结合有关在PCR或RT-PCR中利用。常规上将30个碱基对及以上长度的寡核苷酸用于该目的。在RNA印迹技术中，例如，严格条件可理解为使用洗涤溶液，例如含有0.1％SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)，于50-70℃，优选在60-65℃的温度，以洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸。关于这点，如上所述，保持相互结合的唯一核酸是那些高度互补的核酸。严格条件的建立为技术人员已知并例如在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley amp; Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
通过筛选基因组或cDNA文库并且，适当时，使用合适的引物通过PCR从中扩增并随后，例如用合适的探针分离可以发现这些多核苷酸。而且，根据本发明的多核苷酸也可以化学合成。
根据本发明的构建体的实施方案此外，本发明还涉及表达构建体，所述构建体含有处于调节核酸序列的基因控制下的编码根据本发明的多肽的核酸序列；本发明还涉及包含这些表达构建体的至少一种的载体。
根据本发明的这些构建体优选地包含给定编码序列的5’-上游的启动子和3’-下游终止子序列以及还有，适宜时，另外的常规调节元件，所述调节元件在每种情况下有效连接编码序列。
“有效连接”可理解为启动子、编码序列、终止子以及，适宜时，另外的调节元件的顺序排列，这样使得每个调节元件能够依照需要完成它们与表达编码序列中有关的功能。可有效连接的序列的实例是导向序列和增强子、多聚腺苷酸化信号等。其他调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中描述。
根据本发明的核酸构建体具体可理解为这样的共建体，其中根据本发明的脱氢酶的基因有效地或功能性地连接至一种或多种调节信号用以调节(如增加)基因的表达。
除了这些调节序列，位于实际的结构基因上游的这些序列的天然调节可仍然存在并且，适宜时，已经受到遗传改变，从而自然调节已经关闭并且基因的表达已经增加。然而，核酸构建体也可以具有更简单的组成，即没有将额外的调节信号插入编码序列的上游，并且天然调节启动子及其调节没有被除去。另一种方法是将天然调节序列突变从而不再具有任何调节作用并且基因的表达得以增加。
优选的核酸构建体也有利地含有一个或多个先前提到的增强子序列，其功能性地连接至启动子并使得有可能增强核酸序列的表达。在DNA序列的3’端插入额外的有利序列，如其他调节元件或终止子也是可能的。根据本发明的核酸可在构建体中以一个或多个拷贝存在。对于构建体的选择适宜时，构建体也可含有额外的标记，如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因。
对根据本发明的方法有利的调节序列存在于例如启动子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL启动子中，所述启动子可有利地用于革兰氏阴性细菌中。其它有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中以及存在于酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28和ADH中。例如来自汉逊酵母(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶启动子在这方面也是有利的。使用人造启动子来调节也是可能的。
为了在宿主生物中表达，将核酸构建体有利地插入至使得基因在宿主中能佳表达的载体，如质粒或噬菌体中。除了质粒和噬菌体，载体也可理解为技术人员已知的任何其它载体，即例如，病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、线状和环状DNA。这些载体在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体构成了本发明的另一实施方案。合适的质粒的实例是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11和pBdCI，链霉菌(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361，芽孢杆菌(Bacillus)中的pUB110、pC194和pBD214，棒状杆菌(Corynebacterium)中的pSA77和pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2和pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13和pEMBLYe23，以及植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51。这些质粒构成了可能的质粒的一小部分。其他质粒为技术人员公知并且有关它们的信息可从例如Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 9040 18)这本书中获得。
为了表达存在的其它基因，核酸构建体有利地还含有用于增加表达的3’-端和/或5’-端调节序列，选择所述序列以依赖所选宿主生物和基因最佳地表达。
这些调节序列应该使得基因选择性地表达以及使得蛋白质表达。这可例如表示，取决于宿主生物，基因仅在诱导后表达或过量表达，或基因立刻表达和/或过量表达。
关于这一点，调节序列或因子可优选地正影响，并因此增加导入的基因的表达。因而，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子可在转录水平上有利地增强调节元件。然而，除此之外，也可能通过例如提高mRNA的稳定性来增强翻译。
在载体的另一实施方案中，根据本发明的核酸构建体或含有根据本发明的核酸的载体也可有利地以线性DNA的形式插入至微生物中或通过异源重组或同源重组整合至宿主生物的基因组中。这种线性DNA可由线性化的载体如质粒，或仅由根据本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了能在生物中最优地表达异源基因，根据该生物中使用的特定密码子选择改变核酸序列是有利的。借助于来自所述生物的其它已知基因的计算机分析，可容易地确定密码子选择。
通过将合适的启动子融合至合适的编码核苷酸序列并融合至终止子信号或多聚腺苷化信号制备根据本发明的表达盒。常规重组和克隆技术，如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborotary，Cold SpringHarbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaborotary，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)的技术用于此目的。
为了完成在合适的宿主生物中的表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入至宿主特异载体中，该载体使得基因能在该宿主中最佳地表达。载体为技术人员熟知并且有关它们的信息可例如从“CloningVectors”(Pouwels P.H.等人，Eds.，Elsevier，Amsterdan-New York-Oxford，1985)中获得。
根据本发明可以使用的宿主生物使用根据本发明的载体或构建体来制备重组微生物是可能的，所述重组微生物例如用至少一个根据本发明的载体转化并可用于产生根据本发明的多肽。有利地，将上述根据本发明的重组构建体导入至合适的宿主系统中并得以表达。关于这一点，技术人员熟悉的克隆和转染方法如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等可优选使用以便引起所述核酸在给定的表达体系中表达。合适的系统在例如，Current Protocols inMolecular Biology，F.Ausubel等人Eds.，Wiley Interscience，New York1997，或Sambrook等人Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laborary，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。
根据本发明，也可能制备同源重组微生物。为此，有必要制备包含根据本发明的基因或编码序列的至少一个片段，所述编码序列中，适宜时，已经引入至少一个氨基酸缺失、添加或替代以便修饰，如在功能上破坏(“剔除”载体)根据本发明的序列。导入的序列也可以例如是来自相关微生物的同源物或源于哺乳动物、酵母或昆虫来源。备选地，可以配置(configured)用于同源重组的载体使得和同源重组相关的内源基因受到突变或修饰但仍然编码功能蛋白质(例如，可以修饰下游调节区使得内源蛋白质的表达因此受到改变)。根据本发明的基因的经修饰的片段在同源重组载体中。适合用于同源重组的载体的构建描述于例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503。
原则上，任何原核或真核生物适合用作根据本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物。有利地，将微生物如细菌、真菌或酵母用作宿主生物。有利地使用革兰氏-阳性细菌或革兰氏-阴性细菌，优选肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科(streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，特别优选埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、土壤杆菌属或红球菌属。十分特别优选大肠杆菌(Escherichiacoli)属和种。除此之外，其它有利的细菌可在α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌中找到。
关于这一点，根据本发明的一种或多种宿主生物优选包含在本发明中描述并编码具有根据本发明的脱氢酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或载体的至少一种。
根据本发明的方法中使用的生物取决于宿主生物，以技术人员已知的方式生长或培养。通常，将微生物培育于液体培养基中，该培养基含有通常是糖形式的碳源、通常是有机氮源形式如酵母提取物的氮源或盐，如硫酸铵、痕量元素，如铁盐、锰盐和镁盐以及适宜时，维生素，在0℃-100℃之间，优选在10℃-60℃之间的温度下，同时用氧气充气。在这一点上，营养液的pH可保持固定值，其在培养期间受到调节或不调节。培养可以分批式、半分批式或连续地进行。营养物可最初在发酵的开始引入或随后半连续地或连续地加料。可以直接将酮加入至培养物中或有利地，在培养后加入。酶可用描述于实施例的方法从生物中分离或将酶以粗提物形式用于反应。
重组制备根据本发明的多肽本发明进一步涉及用于重组制备根据本发明的多肽或其功能的、生物学活性片段的方法，所述方法包括培养产生多肽的微生物，诱导多肽的表达，适宜时，并将这些多肽从培养物中分离。如果希望，也可以以这种方法在工业规模上生产所述多肽。
可根据已知的方法培养和发酵重组微生物。可例如在TB培养基或LB培养基中并在20-40℃的温度和pH6-9下繁殖细菌。合适的培养条件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中详细描述。
如果多肽没有分泌进培养基，那么破裂细胞并用已知的蛋白质分离方法从溶解产物获得产物。可如希望的通过高频超声波、通过高压，如在弗氏压碎器(French pressure cell)中，通过渗透裂解(osmolysis)、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用、通过使用匀浆器或通过所引用的几种方法的组合破裂细胞。
使用已知的层析方法如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q Sepharose层析、离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常规的方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳法可纯化多肽。合适的方法例如在Coorper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemical methods ofoperation]，verlag Walter de Gruyter，Berling，New York，或在Scopes，R.，Protein purification，Springer Verglag，New York，Heidelberg，Berlin中详细描述。
为了分离重组蛋白质，可有利地使用载体系统或寡核苷酸，其通过特定的核酸序列延伸cDNA并因此编码用于例如简化纯化的经改变的多肽或融合蛋白质。此类合适的修饰的实例是所称作用作锚的标签，例如称为六组氨酸锚的修饰，或由抗体识别为抗原的表位(例如，在Harlow，E.和Lane，D.，1988，AntibodiesA Laboratory Mannual.Cold SpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚可用于将蛋白质连接至固相支持体，如聚合物基质，所述固相支持体可以填装在层析柱中，或将蛋白质连接至微量滴定板或连接至另一支持体。
同时，这些锚也可用于识别蛋白质。为了识别蛋白质，也可能使用常规的标记如荧光染料、酶标记，该酶标记在和底物反应后形成可检测的反应产物，或放射性标记，它们自己或者与锚组合用来衍生蛋白质。
实施根据本发明的酶促还原方法的其它实施方案在根据本发明的方法中，可将脱氢酶用作游离的或固定化酶。
可将根据本发明的方法有利地在0℃-95℃、优选10℃-85℃、特别优选15℃-75℃的温度下实施。
在根据本发明的方法中，将pH有利地保持在pH 4-12之间、优选地在pH 4.5-9之间、特别优选在pH 5-8之间。
在根据本发明的方法中，对映体纯的或手性产物如3-氯-1-(噻吩-2-基)-(S)-丙-1-醇可理解为表现出对映体富集的对映体。优选在该方法中获得至少70％ee，优选至少80％ee，特别优选至少90％ee，十分特别优选至少98％ee的纯度。
对于根据本发明的方法，可能使用含有根据本发明的核酸、核酸构建体或载体的生长细胞。也可能使用静息或破裂的细胞。破裂的细胞可理解为，例如是已经通过例如溶剂处理使得可渗透的细胞，或已经通过用酶处理、通过机械处理(如弗氏细胞压碎器或超声波)或通过另一方法处理破裂的细胞。以这种方式获得的粗提物有利地适合于根据本发明的方法。也可能将纯化的酶或部分纯化的酶用于本方法。可有利地用于反应的经固定的微生物或酶是同样合适的。
根据本发明的方法可分批式、半分批式或连续地进行。
本方法可有利地在生物反应器中进行，所述反应器如在Biotechnology，卷3，第二版，Rehm等人Eds.，(1993)中，特别是第二章中描述。
下面的实施例目的在于阐明本发明而非限制本发明。在这方面，读者参考包含的图，其中
图1显示用于根据本发明分离的Lu10288脱氢酶的活性染色凝胶；泳道1分子量标准，从下到上47kDa、74kDa、121kDa和205kDa；泳道2空白；泳道3匀浆上清液；泳道4Q Sepharose有用的级分；泳道5QSepharose有用的级分(三倍量)；泳道6Superdex有用的级分；泳道7Mono-Q有用的级分；泳道8Mono-P有用的级分；图2A和2B显示用于通过短乳杆菌脱氢酶还原制备(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S的不同混合物的典型反应顺序。
图3A显示根据本发明分离的Lu10288脱氢酶的印迹带的N-端测序结果。图3B显示根据本发明纯化的Lu10288脱氢酶的不同蛋白质水解片段的测序数据；当每一测序步骤获得几个信号时就有可能确定主要序列，这通过双下划线描述。无法认清的位置用“/”标记；对于对它的识别有点不确定的位置，氨基酸残基在括号中给出。当不可能指定任何明确的优选时，在一个位置上给出两个氨基酸。“？”表示未知或无法识别的氨基酸。
实施例A.化学实施例实施例1制备3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮III.1最初将33kg噻吩引入150kg二氯乙烷中，之后加入62.7kg三氯化铝。将反应混合液冷却至10℃并加入55kg 3-氯丙酰氯。随后将混合物于室温搅拌12小时。用GC和NMR检查表明该反应混合物仍然含有基于所形成DMSO浓度调节到0.2％。不含有任何一种测试试样的溶液作为阴性试样。对II型糖尿病模型小鼠，每日一次用探棒口服给予1mL任意一种测试试样溶液，持续40天。此外，给予模型小鼠β-谷甾醇(TamaBiochemical Co.，Ltd.)作为对照试样1.通过Antsense II(Bayer-SankyoCo.，Ltd.)测量一段时间内的空腹血糖值和随机血糖值。该空腹血糖值在空腹15小时后测量。此外，在从给药开始的第35天，通过DCA 2000(Bayer-Sankyo Co.，Ltd.)测量血红蛋白Alc水平。
(3)结果(血糖值和血红蛋白Alc水平)在测试试样给药周期内随机血糖值和空腹血糖值随时间的改变示于图1和2中。尽管在给予阴性试样或对照试样1的小鼠中都观察到随机血糖值和空腹血糖值急剧增加，但是在给予测试试样1、2和3的小鼠中清楚地重复观察到了抑制血糖值增加的作用。
在从给药开始的第35天血红蛋白Alc水平的测量结果示于表1中。与给予阴性试样后血红蛋白Alc水平相比，在给予测试试样1或2后观察到明显减少了15-26％。相比之下，在给予对照试样1后仅观察到约0.5％的减少，且几乎没有观察到使血红蛋白Alc降低的作用。此外，在给药期间或给药后没有病例显示急性低血糖病症，从体重和病理检查所见的观察点也没有观察到不利的副作用症状。
表1 进行该测试以便评估本发明化合物以及在临床实践中使用的抗糖尿病药物的使血红蛋白Alc降低的作用。
(1)制备试样每一情况中将150ml培养基在两个1升三角瓶中灭菌并补充5ml无菌盐溶液。在从LB氨苄青霉素琼脂板中接种后，将预培养物于37℃和200转/分钟孵育12小时并加入至发酵培养基。发酵于37℃，0.1巴内压和pH7.0(用20％磷酸和25％NaOH调节)时开始，通气速率是7.5l/分钟和在300转/分钟下(将pO2调节至20-50％之间，空气以10-20l/分钟和500-1500转/分钟进入)。2小时后，加入0.1mM IPTG用于诱导并且总共13小时后终止发酵。收获并洗涤细胞(1.3kg)后，将它们于-20℃保存直至使用(混合液中2-20g/l)。
实施例4筛选用于还原3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的脱氢酶a)将不同的细菌和真菌菌株(主要来自多个菌株保藏中心)于30℃或37℃下在20ml LB培养基、MRS培养基(来自Difco)或GYP培养基(用于酵母)(1％w/v D-葡萄糖，每一情况中0.5％w/v酵母提取物和聚胨，pH 6.0)中培育24-48小时，并用3mM Tris-HCl，pH 7.5洗涤且重悬浮于2ml缓冲液中。用1体积玻璃珠(直径为0.3-0.5mm)在振动碾磨机(3×5分钟，每隔10分钟在冰上冷却)中将等分试样破裂。通过离心(于4℃以14000转/分钟5分钟)将混浊物分离后，获得澄清粗提物。随后测定细胞悬浮液和粗提物还原实施例3的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的活性。
使用的测定法
150μl细胞/粗提物50μl 1M葡萄糖溶液50μl来自实施例3的葡萄糖脱氢酶(12-15U/μl；20-200mg MBM/ml)50μl 2mM NADH50μl 2Mm NADPH10μl溶于甲醇中的0.5M 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮190μl 50mM MES，pH 6.0或Tris-HCl，pH 7.5孵育在30℃下进行。在1、2或24小时后用3μl浓HCl终止样品(200μl)。离心后，用HPLC分析上清液的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇(Chromolith Speed ROD，RP-18e 50-4.6mm，流速1.5ml/分钟，0.0-1.0分钟35％乙腈+65％10mM KH2PO4缓冲液，pH2.5；1.1-1.3分钟80％乙腈+20％10mM KH2PO4缓冲液，pH 2.5；1.3-2.0分钟35％乙腈+65％10mM KH2PO4缓冲液，pH 2.5；于230nm(醇)和260nm(酮)，保留时间Rt＝1.250分钟(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)和Rt＝1.500分钟(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮)时检测；在Rt＝0.971分钟和Rt＝1.165分钟时测定通过HCl消除可能得到的副产物(1-噻吩-2-基丙烯-1-酮和1-噻吩-2-基丙烯-1-醇)。
重复测定选择的菌株，用甲基叔丁基醚(MTBE)或甲基异丁基酮(MIBK)萃取样品，并用手性GC分析或HPLC分析表征样品以便测定对映体过量(ee)。将以下方法用于该目的GCHydrodex-β-6-TBDM，25m，90℃10分钟5℃/分钟180℃10分钟，运行时间38分钟，出口加热器200℃，压强106.8kPa，总流速102ml/分钟，分流比125∶1，分流99.8ml/分钟，检测器200℃或HPLCChiracel OD-H，250*4.6mm(Daicel)，40℃，流速1.0ml/分钟，0.0-1.0分钟97.5％正己烷+2.5％异丙醇；于230nm(醇)和260nm(酮)在Rt 9.50(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮)，Rt 16.60分钟(R-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)和Rt 18.30分钟(S-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)下测定。
b)新近分离多种乳杆菌如下将短乳杆菌菌株Lu10288、10290和10291分离。
b1)使用的培养基Kleymann′s培养基将下面物质溶于915ml的10g/l胰蛋白胨(Difco-Becton Dickinson)7g/l酵母提取物(Difco-Becton Dickinson)2g/l牛肉膏(Difco-Becton Dickinson)5g/l果糖2g/l麦芽糖3.6g/l葡糖酸50％1.9g/l柠檬酸*H2O5g/l乙酸盐1g/l吐温800.2g/l MgSO4*7H2O0.05g/l MnSO40.01g/l FeSO40.4g/l L-半胱氨酸1.25ml NH4OH(25％)对于琼脂板加入2％Bacto Agar(Difco-Becton Dickinson)将溶液pH调节为5.4。
将溶液于120℃高压灭菌15分钟。
高压灭菌后，加入50ml无菌葡萄糖溶液(5g，用H2O补足至50ml)和40ml乙醇搅拌下加入并灌琼脂板。
KMB培养基10g/l胰蛋白胨(Difco-Becton Dickinson)7g/l酵母提取物(Difco-Becton Dickinson)2g/l KH2PO41g/l吐温80
0.5g/l MgSO4*7H2O1g/l MnSO420g/l CaCO310g/l葡萄糖用1.5％琼脂制备琼脂板。
将溶液于120℃高压灭菌15’。
将葡萄糖和CaCO3(Riedel de Haen)溶解并分别高压灭菌，在倒入平板之前与琼脂混合。
b2)分离微生物将来自德国北部地区(LUFA-Oldenburg)的5-10g玉米青贮饲料于37℃在50ml三角瓶中用20ml盐水过夜厌氧孵育。将得到的液体部分以1∶100的比率接种到50ml Kleymann培养基而且将后者于RT下厌氧孵育24小时同时进行轻微搅拌。之后，将细胞悬浮物接种至所述Kleymann选择琼脂板。将平板于37℃厌氧孵育48-72小时并通过将在KMB培养基上反复划线培养分离所得菌落。
通过测定含有20g果糖/L(24小时，37℃，50转/分钟)的液态KMB培养基中的酸发酵模式(测定pH值并通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、果糖、乳酸盐、乙酸盐和乙醇的浓度)表征菌株。通过分析16sRNA来分离及系统地表征形成乙酸盐和乳酸盐的异型发酵菌株。
c)筛选结果表1、2和3显示菌株和/或转化及ee值的实例。
表1
表2转化
n.d.未确定基于形成的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇(nM)的转化表3包括ee值测定的反复试验
实施例5纯化来自短乳杆菌的脱氢酶制备下面的培养基用于发酵短乳杆菌Lu10288
从MRS琼脂板接种2个预培养物，将预培养物于37℃和200转/分钟孵育17小时并将其加入发酵培养基。发酵于37℃、0.1巴内压和pH 5.8时开始，通气速率为1升/分钟和100转/分钟(无pO2调节)，在23小时后OD600为14.8时终止。
与实施例4a)类似，使用MES pH 6.0中的静息细胞测定经洗涤的细胞样品的活性。
如下纯化Lu10288脱氢酶匀浆使用100ml MES缓冲液，1mM MgCl2，pH 7.1将100g Lu10288(短乳杆菌)的潮湿生物量以5×20g份重悬浮，并使用玻璃珠(直径为0.1mm-0.2mm，50ml重悬浮细胞对50ml玻璃珠)将生物量以10份于4000转/分钟下在球磨机中匀浆20分钟同时用冰块冷却。通过G2玻璃抽滤器将玻璃珠分离并用20ml缓冲液洗涤。随后将收集到的匀浆(610ml)于12000转/分钟在GSA转子中澄清20分钟。
a)Q-Sepharose离子交换层析将直径是5cm体积为400ml的Q-Sepharose fast flow(Pharmacia)柱在20mM MES缓冲液，1mM MgCl2，pH 6.8中平衡。用11片Complete(蛋白酶抑制剂混合物，Roche，Complete，无EDTA；目录号1873580)处理610ml匀浆并以10ml/分钟的上样速率上样至Q-Sepharose柱上。在280nm检测。随后用三个柱体积的相同缓冲液洗涤Q-Sepharose柱。使用20mM MES、1mM MgCl2、1M NaCl，pH 6.8(100分钟内从0％NaCl-100％NaCl)的线性梯度洗脱。收集并测试10ml级分。在HPLC检测中级分42-62对3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮有活性。
b)Superdex分子筛层析将直径是2.6cm且体积为240ml的Superdex 200分子筛柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，每升缓冲液一片Complete(无EDTA)，pH 7.1平衡。将来自Q-Sepharose的有用的级分合并(240ml)并通过缓慢加入124g硫酸铵将其调整到80％饱和度。pH保持为7.1。将溶液于4℃搅拌10分钟并随后于12000转/分钟离心20分钟。将所得沉淀物在5ml平衡缓冲液中重悬浮并将该悬浮液于4摄氏度透析1小时(10kDa排阻体积)。将经透析的溶液分成两个9ml并以每分钟4ml的流速上样至分子筛柱。收集到4ml级分并测试。级分48-56再次对两种底物有活性。
c)Mono-Q离子交换层析将体积为20ml的制备Mono-Q HR柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，pH 7.1平衡。以每分钟4ml的流速将来自Superdex的70ml合并的有用级分上样。Mono-Q HR柱洗涤后，在100分钟内用直到100％20mM MES，1mM MgCl2，0.5M NaCl，pH7.1的线性梯度处理。收集到4ml的级分。合并活性级分(级分36至41)。
d)Mono-P离子交换层析将Mono-P柱(Pharmacia，4ml)用20mM MOPS、1mM MgCl2，pH7.1平衡。以0.75ml/分钟的流速将21ml来自Mono-Q的有用级分上样。洗涤降至基线后，在100分钟内应用直到100％的20mM MOPS，1mMMgCl2，0.5M NaCl，pH7.1的线性梯度处理。收集级分(0.75ml)。将活性级分(34-39)合并。
凝胶中的活性染色用同体积的Novex“native Tris-glycine”样品缓冲液(Novex)稀释样品。将Anamed公司的tris-甘氨酸凝胶(无SDS，1mm厚，10个样品孔)安装在电泳槽(running chamber)内。将Invitrogen公司的“Tris-glycine native”电泳缓冲液(Invitrogen)稀释后用作电泳缓冲液。将样品孔上样并于200V和约50mA开始胶凝电泳。电泳的持续时间约1.5小时。将电泳槽置于冰水中。移出凝胶后，将其置于玻璃盘中并在50mM MES，8mM MgCl2，pH 6.2中洗涤并孵育。
然后将0.35mM NADP和0.35mM NAD、19.6mg NB-四唑和2.1mg吩嗪硫酸乙酯(PES)加入该溶液中的这种凝胶中。然后加入底物(3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇)得到1mM的终浓度。将凝胶保持在黑暗中直到它们变得染色。典型的凝胶在图1中显示。
LU10288脱氢酶的分离总结
UP有用的峰级分*对新鲜样品测定的活性**保存后测定的活性SDS-PAGE和凝胶印迹后通过Edman测序法测定以这种方式纯化的脱氢酶的N端(SEQ ID NO1)。
实施例6纯化木兰假丝酵母脱氢酶为了发酵木兰假丝酵母Lu8742，将两个预培物在含有8g酵母提取物(65％)/l、5g蛋白胨/l、3.5g葡萄糖/l、5g KH2PO4/l、2g MgSO4*7H2O/l，pH 6.0的150ml培养基中在28℃和以200转/分钟生长15小时，并用于接种13.2l含有10.7g葡萄糖/l和4ml tegosipon的类似培养基。发酵于28℃、0.1巴内压和pH 6.0开始，通气速率是5l/分钟和500转/分钟(将pO2调节至＞20％)并且26小时后当OD600为15.1时终止发酵。
匀浆将收获的细胞(378g湿润生物量)悬浮于含有10片Roche Complete(无EDTA)蛋白酶抑制剂(约9×浓缩)的1升50mM MES+1mM MgCl2，pH 6.5中并将细胞在Z04微流化器(Microfluidizer)中以1000巴破裂两次。离心后(20分钟/10000g)，将一半的澄清上清液(1.3升匀浆物)如下面所述纯化。纯化中，于30℃在50mM MES，pH 6.0，0.2mM NaDH/NaDPH，100mM葡萄糖，50μl GDH/ml和10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮中测定经过适当稀释的样品级分的活性。
Q-Sepharose离子交换层析将直径是5cm体积为400ml的Q-Sepharose fast flow(Pharmacia)柱用20mM MES缓冲液、1mM MgCl2，pH 6.8平衡。用11片Complete(蛋白酶抑制剂混合物)处理650ml匀浆并以7.5ml/分钟的上样速率上样至Q-Sepharose柱。在280nm下检测。随后用700ml相同的缓冲液洗涤Q-Sepharose柱。为了洗脱，应用20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8(100分钟内从0％NaCl至100％NaCl)的线性梯度，之后用200ml20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8洗涤Q-Sepharose柱。收集并检测10ml级分。在HPLC检测中级分56-96对3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮有活性。
硫酸铵沉淀将41ml来自Q-Sepharose的有用峰级分用(NH4)2SO4(pH 6.2)达到90％饱和度后，于4℃搅拌30分钟并随后于10000g离心10分钟。将产生的沉淀物悬浮于10ml 20mM MES，1mM MgCl2，1Roche Complete(无EDTA)片/l，pH 6.2中并在Pierce Slide-A-Lyzer(10kDa排阻体积)中对20mM MES、1mM MgCl2、1Roche Complete(无EDTA)片/l，pH 6.2透析该悬浮液30分钟。
Superdex分子过滤层析将直径是2.6cm且体积为240ml的Superdex 200分子筛柱(Pharmacia)用20mM MES，1mM MgCl2，每升缓冲液一片Complete(无EDTA)，pH 6.2平衡。将来自硫酸铵沉淀的透析液(2×7ml)以每分钟4ml的流速上样至分子筛柱。收集并检测4ml级分。级分21-24再次对两种底物都有活性。
Mono-Q离子交换层析将体积为1ml的Mono-Q HR5/5柱(来自Pharmacia公司)用20mMMES，1mM MgCl2，pH6.8平衡。以每分钟1ml的流速将来自Superdex柱的10ml合并的有用级分上样。柱洗涤后，100分钟内用直到100％的20mM MES，1mM MgCl2，0.75M NaCl，pH 6.8的线性梯度处理。收集到1ml级分(226nm检测)。合并活性级分(级分24-27)。
分离结果总结于下表
*(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇AS pptn硫酸铵沉淀UP有用的峰级分SDS-PAGE和凝胶印迹后通过Edman测序法测定以这种方式纯化的脱氢酶的N端(SEQ ID NO2)。
实施例7通过用短乳杆菌脱氢酶还原制备(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇I-S将短乳杆菌Lu10288如实施例4中描述的生长和收获。将静息细胞(10-100g/l生物量)用0.2-2mM NAD(P)+、来自实施例1(分批式或补料分批)的1-100g丙酮和18g葡萄糖/l处理并将细胞于30℃孵育2-8小时。该反应通过用0.5M NaOH滴定保持在pH 6.0-7.0并用HPLC分析监控。图2A和B分别显示对应混合液1和2的典型的反应序列。
混合物19ml Lu10288细胞悬浮液(包含200g MBM/l)
3ml 1M葡萄糖溶液3ml 20mM NADP溶液0.9ml GDH溶液(12-15U/μl)3ml 1M NaCl溶液11.1ml水+10mM酮(来自实施例1)1小时后再加入10mM酮。
混合物29ml Lu10288细胞悬浮液(200g MBM/l)3ml 1M葡萄糖溶液3ml 2mM NADP溶液3ml 2mM NAD溶液0.9ml GDH溶液(12-15U/μl)3ml 1M NaCl溶液11.1ml水+10mM酮(0.6ml溶于甲醇中的0.5M来自实施例1的酮)每种情况中，45、110、180和300分钟后再加入10mM酮。
随后，通过离心和/或过滤将生物量除去。NMR分析MTBE提取物得到60-70％含量的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇。每种情况中未反应的3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮和副产物1-噻吩-2-基丙烯-1-酮的含量少于10％。仅可能测定痕量的1-噻吩-2-基-丙烯-1-醇。
随后将1.1g 40％含水甲胺溶液加至无细胞含水混合物中。随后将后者在内压下于60℃搅拌6小时。混合物已经冷却至室温后，除去溶剂；随后用甲苯消化残渣并从中滤出。备选地，可以在氨基化反应后进行细胞分离。将滤液干燥后，获得202mg淡黄色固体形式的标题化合物。获得对映体过量值ee为95％的S对映体。通过测定旋光量(c＝1，溶剂∶甲醇)并使用ShiftNMR(Shift试剂2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(+)(TFAE)；溶剂CDCl3；500MHz)来测定ee值。
实施例8从短乳杆菌Lu10288克隆脱氢酶a)进行原生质化后从Lu10288制备染色体DNA(1)所需溶液溶液1∶0.41M蔗糖0.01M MgSO4*7H2O5ml/l M12培养基1∶210ml/l 10％KH2PO4pH 6.72.5mg/ml溶菌酶(临用前加入)如下制备溶液1将14.03g蔗糖、0.25g MgSO4*7H2O、5ml M12(10倍浓缩)和1ml 10％KH2PO4，pH 6.7补足至100ml并通过过滤除菌。
蛋白酶来自Qiagen公司，20mg/ml贮存液RNA酶来自Qiagen公司，100mg/ml贮存液TE缓冲液10mM Tris*Cl pH 8，1mM EDTA pH 8(2)培养和破裂-于37℃和200转/分钟在250ml带挡板的锥形瓶中的100ml MRS培养基(来自Difco)中培养过夜。
-离心细胞4000转/分钟，10分钟，4℃-丢弃上清液并将沉淀物吸收于5ml溶液1(+溶菌酶)并充分重悬浮。在培养箱(37℃)中孵育1-4小时。
-小心离心原生质体3000转/分钟，10分钟-去除上清液，用10ml溶液1(无溶菌酶)洗涤沉淀物3000转/分钟，4℃，8分钟。
-丢弃上清液，用10ml 0.01M Tris-HCl，pH 8.0洗涤沉淀物3000转/分钟，4℃，8分钟。
-丢弃上清液，将沉淀物在4ml TE缓冲液中重悬浮。
-加入0.5ml10％SDS和0.5ml 5M NaCl，小心混合。
-加入1mg蛋白酶K(Qiagen蛋白酶20mg/ml，即50μl)并在培养箱中于37℃孵育过夜。
-用TE缓冲液补足混合物至20ml。
(3)萃取-按1∶1加入苯酚，即20ml苯酚+20ml混合物。小心混合并于4℃以4000转/分钟离心5分钟。
-移走上面的相并转移至新的Falcon(20ml)中。
-加入20ml苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。小心混合并于4℃以4000转/分钟离心5分钟。
-移走上面的相并转移至新的Falcon(约18ml)中。
-加入18ml氯仿∶异戊醇(24∶1，即18ml氯仿+333μl异戊醇)。小心混合并于4℃以4000转/分钟离心5分钟。重复这一步骤直至上面的相澄清。
-用2体积乙醇(36ml)沉淀上面的相(18ml)。加入1/50 3M乙酸钠(约360μl)。将沉淀置于-20℃至少30分钟。之后，于4℃以12000转/分钟离心30分钟。
-丢弃上清液，将沉淀物吸收于1-2ml TE缓冲液中。每毫升TE缓冲液加入20μg RNA酶。
孵育37℃水浴中1h。
(4)透析用RNA酶处理后，将混合物转移至透析袋。在1.5L TE缓冲液中于4℃透析3次每次1小时。也可以将最后的透析步骤过夜进行。
-将透析的DNA转移至Falcon管中并等分至几个Eppendorff管(500μl)中。
-加入2体积的乙醇(1000μl)和1/3体积的2M LiCl(166μl)。
-于-20℃沉淀至少30分钟。之后，于4℃以12000转/分钟离心30分钟。
-小心地倒出上清液。
-用20ml 70％的乙醇洗涤沉淀物并于4℃以12000转/分钟离心15分钟。
-小心倒掉上清液，让沉淀物在空气中干燥并将DNA吸收于合适体积的10得到装饰材料。肉眼观察到该装饰材料的导管部与实施例8制造的装饰材料相比较，为缺乏锐度的形状。
实施例9使导管油墨中的二氧化硅含量为20质量％，除此以外与实施例8同样进行，得到装饰材料。肉眼观察到该装饰材料的导管部的光泽不太低，作为设计感未必足够，但导管部为锐利的形状。
实施例10将导管油墨中使用的版改变版深而制版，使油墨的转移量不同，除此以外与实施例8同样进行，得到装饰材料。版深最深的部分为70μm，无阶梯地调整版深，制成从没有槽(cell)的部分到深度70μm的部分的层次版。与没有槽的部分相对应的部分的光泽为光泽值60，与版深30-40μm相对应的部分的光泽，为光泽值30，与版深60-70μm相对应的部分的光泽，为光泽值10，其之间光泽连续地无阶梯地变化。通过使用该版，并使用本发明的导管油墨，可以得到更接近天然物的木纹色调的装饰材料。
实施例11在电子射线固化性树脂组合物中进一步加入煅烧高岭土10质量份(平均粒径1.5μm)，除此以外与实施例1同样进行，得到装饰材料。对于该装饰材料，对光泽、耐水性、随时间经过的剥离性、耐污染性及マ-リング性能进行评价。表3示出其结果。通过添加煅烧高岭土，与实施例1得到的装饰材料相比，マ-リング性进一步提高。
表3
1MSNRLDGKVA IVTGGTLGIG LAIATKFVEE GAKVMITGRH SDVGEKAAKS51VGTPDQIQFF QHDSSDEDGW TKLFDATEKA FGPVSTLVNN AGIAVNKSVE101ETTTAEWRKL LAVNLDGVFF GTRLGIQRMK NKGLGASIIN MSSIEGFVGD151PSLGAYNASK GAVRIMSKSA ALDCALKDYD VRVNTVHPGY IKTPLVDDLP201GAEEAMSQRT KTPMGHIGEP NDIAYICVYL ASNESKFATG SEFVVDGGYT251AQ*SEQ ID NO3Lu10288脱氢酶的核酸序列(及反义链)1ATGTCTAACC GTTTGGATGG AAAAGTAGCA ATCGTTACAG GTGGTACGTTTACAGATTGG CAAACCTACC TTTTCATCGT TAGCAATGTC CACCATGCAA51GGGTATCGGT TTAGCTATCG CCACGAAGTT CGTTGAAGAA GGGGCTAAGGCCCATAGCCA AATCGATAGC GGTGCTTCAA GCAACTTCTT CCCCGATTCC101TCATGATTAC CGGCCGGCAC AGCGATGTTG GTGAAAAAGC AGCTAAGAGTAGTACTAATG GCCGGCCGTG TCGCTACAAC CACTTTTTCG TCGATTCTCA151GTCGGCACTC CTGATCAGAT TCAATTTTTC CAACATGATT CTTCCGATGACAGCCGTGAG GACTAGTCTA AGTTAAAAAG GTTGTACTAA GAAGGCTACT201AGACGGCTGG ACGAAATTAT TCGATGCAAC GGAAAAAGCC TTTGGCCCAGTCTGCCGACC TGCTTTAATA AGCTACGTTG CCTTTTTCGG AAACCGGGTC251TTTCTACATT AGTTAATAAC GCTGGGATCG CGGTTAACAA GAGTGTCGAAAAAGATGTAA TCAATTATTG CGACCCTAGC GCCAATTGTT CTCACAGCTT301GAAACCACGA CTGCTGAATG GCGTAAACTA TTAGCCGTCA ACCTTGATGGCTTTGGTGCT GACGACTTAC CGCATTTGAT AATCGGCAGT TGGAACTACC351TGTCTTCTTC GGTACCCGAT TAGGGATTCA ACGGATGAAG AACAAAGGCTACAGAAGAAG CCATGGGCTA ATCCCTAAGT TGCCTACTTC TTGTTTCCGA401TAGGGGCTTC CATCATCAAC ATGTCTTCGA TCGAAGGCTT TGTGGGTGATATCCCCGAAG GTAGTAGTTG TACAGAAGCT AGCTTCCGAA ACACCCACTA451CCTAGCTTAG GGGCTTACAA CGCATCTAAA GGGGCCGTAC GGATTATGTCGGATCGAATC CCCGAATGTT GCGTAGATTT CCCCGGCATG CCTAATACAG501CAAGTCAGCT GCCTTAGATT GTGCCCTAAA GGACTACGAT GTTCGGGTAAGTTCAGTCGA CGGAATCTAA CACGGGATTT CCTGATGCTA CAAGCCCATT551ACACTGTTCA CCCTGGCTAC ATCAAGACAC CATTGGTTGA TGACCTACCATGTGACAAGT GGGACCGATG TAGTTCTGTG GTAACCAACT ACTGGATGGT601GGGGCCGAAG AAGCGATGTC ACAACGGACC AAGACGCCAA TGGGCCATATCCCCGGCTTC TTCGCTACAG TGTTGCCTGG TTCTGCGGTT ACCCGGTATA651CGGTGAACCT AACGATATTG CCTACATCTG TGTTTACTTG GCTTCTAACGGCCACTTGGA TTGCTATAAC GGATGTAGAC ACAAATGAAC CGAAGATTGC701AATCTAAATT TGCAACGGGT TCTGAATTTG TAGTTGACGG TGGCTACACTTTAGATTTAA ACGTTGCCCA AGACTTAAAC ATCAACTGCC ACCGATGTGA751GCTCAACGAGTT实施例9测定短乳杆菌Lu10288的重组脱氢酶的活性将质粒pDHE10288adh1再转化至大肠杆菌TG10 pAgrO4pHSG575(TG10大肠杆菌TG1(Stratagene)的RhaA衍生物；pAgrO4Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1978)Gene 61，63-74；pHSG575T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。
每种情况中，将6株转化体在(带挡板的)100ml三角瓶中的20mlLBAmp/Spec/Cm(100μg Amp/l；50mg Spec/l；10μg Cm/l)、0.1mM IPTG、0.5g鼠李糖/l中于37℃下生长18小时，随后于5000g离心10分钟，用10mM Tris/HCl，pH7.0洗涤一次，并在2ml相同的缓冲液中重悬浮。将100μl细胞悬浮物在含有50μl葡萄糖DH/ml(实施例1)、100mM葡萄糖、100mMNaCl、1mM NADH、1mM NADPH和10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-酮的900μl 50mM MES，pH 6中摇动下孵育20分钟。与实施例4类似分析混合物。平均形成了0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇，对应于6.6U/l培养悬浮物的活性。在含有粗提物的类似测定样品中，测定出0.21mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇对应于10.7U/l的活性的样品，通过在振动碾磨机(3×5分钟，中间间隔在冰上冷却)中使用0.7ml玻璃珠(d＝0.5mm)进行细胞破裂获得所述粗提物。在培养过程未加入鼠李糖的对照实验中不可能检测到3-氯-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇。
实施例10从木兰假丝酵母Lu8472克隆脱氢酶使用Edmann测序法再次测定N-端序列后，从实施例6中描述的蛋白质纯化中获得下面的氨基酸序列(S，G或T)(T或P)TSNALVTGGSRGIGAA在肽的胰蛋白酶消化和Edmann测序后获得下面另外的氨基酸序列IGVNSINPG考虑木兰假丝酵母密码子选择，从肽推导出核酸序列(引物Mke366、367和374)，其如下使用用于通过PCR扩增从Lu8472染色体DNA(使用3倍浓缩的溶细胞酶溶液的Genomic DNA试剂盒，Qiagen，Hilden)克隆脱氢酶基因。
PCR
引物
将引物Mke366和Mke367以1∶1混合。根据标准Stratagene方案使用Pfu Turbo-聚合酶(Stratagene)和下面的温度梯度程序实施PCR95℃1分钟；30次循环的95℃1分钟，X℃145秒和72℃2分钟；72℃10分钟；10℃直到使用。使用琼脂糖凝胶电泳(1.2％E-胶，Invitrogen)和层析柱(GFX-试剂盒，Amersham Pharmacia)将PCR产物(～0.5kb)分离并且随后测序(测序引物Mke366和Mke374)。产生的序列在SEQ ID NO5中描述。从它推导的氨基酸序列(SEQ ID NO6)显示与木兰假丝酵母碳酰还原酶(WO200140450)有53％的同一性。蛋白质纯化后测定的肽序列仅存在小的分歧。差别可能是由于测序误差或是由于木兰假丝酵母Lu8742中存在一些同工酶。
SEQ ID NO6 Lu8742脱氢酶的部分氨基酸序列1NALVTGGSRG IGEATAIKLA EEGYSVTIAS RGLKQLEAVK AKLPIVKQGQ51VHHVWQLDLS DVDAAAAFKG SPLPASRYDV LVSNAGVAQF SPFIEHAKQD101WSQMLAINLA APIALAQTFA KAIGDKPRNT PAHIVFVSSN VSLRGFPNIG151VNSITPGSEQ ID NO5 Lu8742脱氢酶的部分核酸序列(及反义链)
1AACGCGCTGG TGACGGGCGG CAGCCGCGGC ATTGGCGAAG CCACTGCCATTTGCGCGACC ACTGCCCGCC GTCGGCGCCG TAACCGCTTC GGTGACGGTA51TAAGCTCGCC GAGGAGGGCT ACAGCGTCAC GATTGCGTCT CGCGGCCTTAATTCGAGCGG CTCCTCCCGA TGTCGCAGTG CTAACGCAGA GCGCCGGAAT101AGCAGCTCGA GGCTGTGAAG GCCAAACTAC CCATTGTGAA GCAGGGACAGTCGTCGAGCT CCGACACTTC CGGTTTGATG GGTAACACTT CGTCCCTGTC151GTTCACCACG TGTGGCAGCT TGATCTCAGT GATGTCGACG CTGCGGCCGCCAAGTGGTGC ACACCGTCGA ACTAGAGTCA CTACAGCTGC GACGCCGGCG201CTTCAAAGGG TCGCCGCTAC CTGCCAGCCG CTACGACGTG CTCGTCAGCAGAAGTTTCCC AGCGGCGATG GACGGTCGGC GATGCTGCAC GAGCAGTCGT251ATGCTGGCGT GGCCCAGTTT AGCCCGTTCA TCGAGCATGC GAAGCAGGACTACGACCGCA CCGGGTCAAA TCGGGCAAGT AGCTCGTACG CTTCGTCCTG301TGGTCGCAGA TGCTTGCCAT CAATCTGGCG GCACCCATTG CGCTGGCCCAACCAGCGTCT ACGAACGGTA GTTAGACCGC CGTGGGTAAC GCGACCGGGT351GACATTTGCT AAGGCCATTG GCGACAAGCC GCGCAACACA CCGGCCCACACTGTAAACGA TTCCGGTAAC CGCTGTTCGG CGCGTTGTGT GGCCGGGTGT401TTGTGTTTGT CTCGTCGAAC GTCTCGTTGC GAGGCTTCCC GAACATCGGCAACACAAACA GAGCAGCTTG CAGAGCAACG CTCCGAAGGG CTTGTAGCCG451GTCAACTCCA TCACCCCCGG CACAGTTGAGGT AGTGGGGGCC GT112个测定样品在不同的退火温度下进行，即从25℃-45℃(每种情况Delta约2℃)。在所有的测定样品中，形成作为主要产物的相似浓度的0.5kb带。
序列表 110 巴斯福股份公司 120 产生3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法 130 M/44142 160 6 170 PatentIn版本3.1 210 1 211 47 212 PRT 213 短乳杆菌 400 1Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30
Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala35 40 45 210 2 211 18 212 PRT 213 木兰假丝酵母 400 2Ser Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Val Ile Gly Ala Gly Gly1 5 10 15Phe Ile 210 3 211 756 212 DNA 213 短乳杆菌 220
221 CDS 222 (1)..(756) 223
400 3atg tct aac cgt ttg gat gga aaa gta gca atc gtt aca ggt ggt acg 48Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15ttg ggt atc ggt tta gct atc gcc acg aag ttc gtt gaa gaa ggg gct 96Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30aag gtc atg att acc ggc cgg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct144Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala35 40 45aag agt gtc ggc act cct gat cag att caa ttt ttc caa cat gat tct192Lys Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser50 55 60tcc gat gaa gac ggc tgg acg aaa tta ttc gat gca acg gaa aaa gcc240Ser Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala65 70 75 80ttt ggc cca gtt tct aca tta gtt aat aac gct ggg atc gcg gtt aac288Phe Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn85 90 95aag agt gtc gaa gaa acc acg act gct gaa tgg cgt aaa cta tta gcc336Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala100 105 110gtc aac ctt gat ggt gtc ttc ttc ggt acc cga tta ggg att caa cgg384Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg115 120 125atg aag aac aaa ggc tta ggg gct tcc atc atc aac atg tct tcg atc432Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile130 135 140gaa ggc ttt gtg ggt gat cct agc tta ggg gct tac aac gca tct aaa480Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys145 150 155 160ggg gcc gta cgg att atg tcc aag tca gct gcc tta gat tgt gcc cta528Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175aag gac tac gat gtt cgg gta aac act gtt cac cct ggc tac atc aag576Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys180 185 190aca cca ttg gtt gat gac cta cca ggg gcc gaa gaa gcg atg tca caa624Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln195 200 205cgg acc aag acg cca atg ggc cat atc ggt gaa cct aac gat att gcc672Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala210 215 220tac atc tgt gtt tac ttg gct tct aac gaa tct aaa ttt gca acg ggt720Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly225 230 235 240tct gaa ttt gta gtt gac ggt ggc tac act gct caa756Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250 210 4 211 252 212 PRT 213 短乳杆菌 400 4Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr1 5 10 15Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala20 25 30Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45Lys Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser50 55 60Ser Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala65 70 75 80Phe Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn85 90 95Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala100 105 110Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg115 120 125Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile130 135 140Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys145 150 155 160Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu165 170 175Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys180 185 190Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln195 200 205Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly225 230 235 240Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250 210 5 211 472 212 DNA 213 木兰假丝酵母 220
221 CDS 222 (1)..(471) 223
400 5aac gcg ctg gtg acg ggc ggc agc cgc ggc att ggc gaa gcc act gcc 48Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly 6lu Ala Thr Ala1 5 10 15att aag ctc gcc gag gag ggc tac agc gtc acg att gcg tct cgc ggc 96Ile Lys Leu Ala Glu Glu 6ly Tyr Ser Val Thr Ile Ala Ser Arg 6ly20 25 30ctt aag cag ctc gag gct gtg aag gcc aaa cta ccc att gtg aag cag144Leu Lys Gln Leu Glu Ala Val Lys Ala Lys Leu Pro Ile Val Lys Gln35 40 45
gga cag gtt cac cac gtg tgg cag ctt gat ctc agt gat gtc gac gct192Gly Gln Val His His Val Trp Gln Leu Asp Leu Ser Asp Val Asp Ala50 55 60gcg gcc gcc ttc aaa ggg tcg ccg cta cct gcc agc cgc tac gac gtg240Ala Ala Ala Phe Lys Gly Ser Pro Leu Pro Ala Ser Arg Tyr Asp Val65 70 75 80ctc gtc agc aat gct ggc gtg gcc cag ttt agc ccg ttc atc gag cat288Leu Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Gln Phe Ser Pro Phe Ile Glu His85 90 95gcg aag cag gac tgg tcg cag atg ctt gcc atc aat ctg gcg gca ccc336Ala Lys Gln Asp Trp Ser Gln Met Leu Ala Ile Asn Leu Ala Ala Pro100 105 110att gcg ctg gcc cag aca ttt gct aag gcc att ggc gac aag ccg cgc384lle Ala Leu Ala Gln Thr Phe Ala Lys Ala Ile Gly Asp Lys Pro Arg115 120 125aac aca ccg gcc cac att gtg ttt gtc tcg tcg aac gtc tcg ttg cga432Asn Thr Pro Ala His Ile Val Phe Val Ser Ser Asn Val Ser Leu Arg130 135 140ggc ttc ccg aac atc ggc gtc aac tcc atc acc ccc ggc a 472Gly Phe Pro Asn Ile Gly Val Asn Ser Ile Thr Pro Gly145 150 155 210 6 211 157 212 PRT 213 木兰假丝酵母 400 6Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Glu Ala Thr Ala1 5 10 15
Ile Lys Leu Ala Glu Glu Gly Tyr Ser Val Thr Ile Ala Ser Arg Gly20 25 30Leu Lys Gln Leu Glu Ala Val Lys Ala Lys Leu Pro Ile Val Lys Gln35 40 45Gly Gln Val His His Val Trp Gln Leu Asp Leu Ser Asp Val Asp Ala50 55 60Ala Ala Ala Phe Lys Gly Ser Pro Leu Pro Ala Ser Arg Tyr Asp Val65 70 75 80Leu Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Gln Phe Ser Pro Phe Ile Glu His85 90 95Ala Lys Gln Asp Trp Ser Gln Met Leu Ala Ile Asn Leu Ala Ala Pro100 105 110Ile Ala Leu Ala Gln Thr Phe Ala Lys Ala Ile Gly Asp Lys Pro Arg115 120 125Asn Thr Pro Ala His Ile Val Phe Val Ser Ser Asn Val Ser Leu Arg130 135 140Gly Phe Pro Asn Ile Gly Val Asn Ser Ile Thr Pro Gly145 150 15权利要求
1.制备式I 的3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中a)在路易斯酸存在下，噻吩与β-卤代丙酰基卤或丙烯酰基卤反应得到3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮，在反应发生同时或之后，但是在分离反应产物之前通入卤化氢，和b)将在a)步骤中获得的丙酮还原并然后，适宜时不分离反应产物而直接与甲胺反应。
2.如权利要求1中要求保护的方法，其中步骤a)中使用的路易斯酸是三氯化铝。
3.如前面权利要求之一要求保护的方法，其中步骤a)中的反应在作为溶剂的卤化烃中进行。
4.如前面权利要求之一要求保护的方法，其中在作为还原剂的过渡金属催化剂存在下，使用金属氢化物或半金属氢化物或使用氢进行步骤b)中的还原。
5.如前面权利要求之一要求保护的方法，其用于制备式I-S 的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，适宜时，与它的R对映体I-R一起的混合物，式I-S的丙醇在该混合物中占优势，其中在手性还原剂或者手性催化剂存在下进行步骤b)中的还原，所述手性还原剂或者手性催化剂显示出对于(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇形成的选择性。
6.如权利要求5中要求保护的方法，其中在不对称过渡金属催化剂存在时，用于步骤b)中的还原剂是不对称金属氢化物或半金属氢化物或氢，或其中在介导不对称诱导的化合物存在下进行所述还原。
7.如权利要求5中要求保护的方法，其中在脱氢酶(E.C.1.1.x.x)存在下进行步骤b)中的还原。
8.如权利要求7中要求保护的方法，其中在脱氢酶(E.C.1.1.1.x)存在下，尤其醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2)存在下进行所述还原。
9.如权利要求7或8中要求保护的方法，其中脱氢酶选自来自地霉属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属或酵母属的酵母的脱氢酶和来自假单胞菌属、伯克霍尔德菌属、土壤杆菌属、红球菌属或乳杆菌属的细菌的脱氢酶。
10.如权利要求9中要求保护的方法，其中脱氢酶选自来自白地霉、木兰假丝酵母和短乳杆菌的脱氢酶。
11.醇脱氢酶和来源于它的功能等价的醇脱氢酶，其中所述醇脱氢酶的氨基酸序列在其N端区包含a)如SEQ ID NO1中描述的至少10个连续氨基酸残基的组成型氨基酸序列，其中对应SEQ ID NO1中描述的氨基酸位置12的位置优选额外地代表缬氨酸；或b)如SEQ ID NO2中描述的至少10个连续氨基酸残基的组成型氨基酸序列；
12.如权利要求11中要求保护的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶能将3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮还原成(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
13.如权利要求12中要求保护的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶以至少85％ ee(NADH和/或NADPH存在下；在30℃和pH 6.0)的对映体纯度催化还原。
14.如权利要求11至13之一要求保护的醇脱氢酶和来源于它的功能等价的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶由包含SEQ ID NO3的核酸序列编码或所述醇脱氢酶包含如SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列或至少如图3中描述的组成型序列，并且可以优选地从短乳杆菌获得。
15.如权利要求11至13之一要求保护的醇脱氢酶和来源于它的功能等价的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶由包含SEQ ID NO5的核酸序列编码或具有包含SEQ ID NO6的氨基酸序列，并且可以优选地从木兰假丝酵母(ATCC 12573)获得。
16.核酸序列和来源于它的衍生物，所述核酸序列包含如权利要求11至15之一要求保护的脱氢酶的编码序列，尤其如SEQ ID NO3和5中描述的核酸序列。
17.表达盒，其包含与至少一种调节核酸序列有效连接的如权利要求15中要求保护的核酸序列。
18.重组载体，其包含至少一种如权利要求16中要求保护的表达盒。
19.原核或真核宿主，其用至少一种如权利要求17中要求保护的载体转化。
20.如权利要求11至14之一中要求保护的脱氢酶，或产生该脱氢酶的天然或重组微生物的用途，用于制备(S)-3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
21.如权利要求7至10之一中要求保护的方法，其中使用的脱氢酶是如权利要求11到14之一中要求保护的醇脱氢酶或者产生该脱氢酶的天然或重组微生物。
22.制备式I-S的(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的方法，其中将3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮对映体选择性地还原，其中在脱氢酶存在下实现所述还原。
23.如权利要求21中要求保护的方法，其中还原中获得的(S)-3-卤代-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇不经分离就与甲胺反应。
24.如权利要求21或22中要求保护的方法，其中脱氢酶选自来自地霉属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属或酵母属的酵母和来自假单胞菌属、伯克霍尔德菌属、土壤杆菌属、红球菌属或乳杆菌属的细菌的脱氢酶。
25.如权利要求23中要求保护的方法，其中脱氢酶选自来自白地霉、木兰假丝酵母或短乳杆菌的脱氢酶。
26.如权利要求21中要求保护的方法，其中脱氢酶选自如权利要求11至15之一中要求保护的醇脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及制备3－甲基氨基－1－(噻吩－2－基)丙－1－醇的酶促和非酶促方法；还涉及实现这些方法的酶；并涉及编码这些酶的核酸序列，涉及含有这些核酸序列的表达盒，还涉及载体和重组宿主。
文档编号C12N15/53GK1860110SQ200480028108
公开日2006年11月8日 申请日期2004年9月30日 优先权日2003年10月1日
发明者R·施蒂默尔, M·凯塞勒, B·豪尔, T·弗里德里希, M·布罗伊尔 申请人:巴斯福股份公司